ফাস্টকিং আরটি কিট (gDNase সহ)

A-1 RNA অবনমিত

No কোন দূষণ ছাড়াই উচ্চ মানের আরএনএ বিশুদ্ধ করুন। আরএনএ অবনতি রোধ করতে যে উপাদান থেকে আরএনএ বের করা হয় তা যতটা সম্ভব তাজা হওয়া উচিত। RT বিক্রিয়ের আগে বিকৃত জেলের উপর RNA অখণ্ডতা বিশ্লেষণ করুন। আরএনএ নিষ্কাশনের পরে, এটি 100% ফর্মামাইডে সংরক্ষণ করা উচিত। যদি RNase ইনহিবিটার ব্যবহার করা হয়, গরম করার তাপমাত্রা <45 ° C, এবং pH 8.0 এর কম হওয়া উচিত, অন্যথায় ইনহিবিটর সমস্ত আবদ্ধ RNase ছেড়ে দেবে। তাছাড়া, RNase ইনহিবিটর solutions 0.8 mM DTT ধারণকারী সমাধানগুলিতে যুক্ত করা উচিত।

A-2 RNA- তে বিপরীত প্রতিলিপি প্রতিক্রিয়াগুলির ইনহিবিটার রয়েছে

Ever রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ইনহিবিটরগুলির মধ্যে রয়েছে এসডিএস, ইডিটিএ, গ্লিসারল, সোডিয়াম পাইরোফসফেট, স্পার্মিডিন, ফর্মামাইড, গুয়ানিডিন লবণ ইত্যাদি নমুনার সাথে কন্ট্রোল আরএনএ মিশ্রিত করুন এবং ইনহিবিটর আছে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য কন্ট্রোল আরএনএ রিঅ্যাকশনের সাথে ফলনের তুলনা করুন। ইনহিবিটরস অপসারণ করতে 70% (v/v) ইথানল দিয়ে আরএনএ বৃষ্টিপাত ধুয়ে নিন।

A-3 সিডিএনএর প্রথম স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারের অপর্যাপ্ত অ্যানিলিং

- নির্ণয় করুন যে অ্যানিলিং তাপমাত্রা পরীক্ষায় ব্যবহৃত প্রাইমারের জন্য উপযুক্ত। এলোমেলো হেক্সামারদের জন্য, প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রায় পৌঁছানোর আগে 10 মিনিটের জন্য তাপমাত্রা 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রাখার সুপারিশ করা হয়। জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমারের (জিএসপি) জন্য, অন্য জিএসপি চেষ্টা করুন, অথবা অলিগো (ডিটি) বা এলোমেলো হেক্সামারে স্যুইচ করুন।

A-4 আরএনএ শুরু করার অল্প পরিমাণ

- RNA এর পরিমাণ বাড়ান। 50 ng এর কম RNA নমুনার জন্য, 0.1 μg থেকে 0.5 μg acetyl BSA প্রথম স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণে ব্যবহার করা যেতে পারে

A-5 বিশ্লেষিত টিস্যুতে লক্ষ্য ক্রম প্রকাশ করা হয় না।

- অন্যান্য টিস্যু ব্যবহার করে দেখুন।

A-6 PCR প্রতিক্রিয়া ব্যর্থ হয়

-দুই ধাপের RT-PCR- এর জন্য, PCR ধাপে cDNA টেমপ্লেট প্রতিক্রিয়া ভলিউমের 1/5 অতিক্রম করতে পারে না।

A-1 প্রাইমার এবং টেমপ্লেটগুলির অ-নির্দিষ্ট অ্যানিলিং

-প্রাইমারের 3'-প্রান্তে 2-3 ডিজি বা ডিসি থাকা উচিত নয়। এলোমেলো প্রাইমার বা অলিগো (ডিটি) এর পরিবর্তে প্রথম স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণে জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করুন। প্রথম কয়েকটি চক্রে উচ্চতর অ্যানিলিং তাপমাত্রা ব্যবহার করুন এবং তারপরে অ্যানিলিংয়ের তাপমাত্রা কম করুন। প্রতিক্রিয়ার নির্দিষ্টতা উন্নত করতে PCR- এর জন্য হট-স্টার্ট তাক DNA পলিমারেজ ব্যবহার করুন।

A-2 জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমারের দুর্বল নকশা

Amp পরিবর্ধন প্রাইমার ডিজাইনের জন্য একই নীতি অনুসরণ করুন।

A-3 RNA জিনোমিক ডিএনএ দ্বারা দূষিত

-PCR- গ্রেড DNase I দিয়ে RNA এর চিকিৎসা করুন। ডিএনএ দূষণ সনাক্ত করতে বিপরীত প্রতিলিপি ছাড়াই একটি নিয়ন্ত্রণ বিক্রিয়া স্থাপন করুন।

A-4 প্রাইমার ডাইমার গঠন

3 'শেষে পরিপূরক সিকোয়েন্স ছাড়া প্রাইমার ডিজাইন করুন।

A-5 খুব বেশি Mg²⁺ একাগ্রতা

Pt অপটিমাইজ এমজি²⁺ প্রতিটি টেমপ্লেট এবং প্রাইমার সংমিশ্রণের জন্য ঘনত্ব

এ -6 বিদেশী ডিএনএ দ্বারা দূষিত

-এরোসোল-প্রতিরোধী টিপস এবং ইউডিজি এনজাইম ব্যবহার করুন।

A-1 প্রথম স্ট্র্যান্ড পণ্যের বিষয়বস্তু খুব বেশি

PC প্রচলিত PCR প্রতিক্রিয়া ধাপে প্রথম স্ট্র্যান্ড পণ্যের পরিমাণ হ্রাস করুন।

পিসিআর বিক্রিয়ায় A-2 খুব বেশি প্রাইমার পরিমাণ

Priপ্রাইমার ইনপুট কমান।

A-3 অনেক বেশি চক্র

PC পিসিআর প্রতিক্রিয়া অবস্থার অপটিমাইজ করুন এবং পিসিআর চক্র সংখ্যা হ্রাস করুন।

A-4 খুব কম অ্যানিলিং তাপমাত্রা

Non অ-সুনির্দিষ্ট দীক্ষা এবং সম্প্রসারণ রোধ করার জন্য অ্যানিলিং তাপমাত্রা বৃদ্ধি করুন।

A-5 ডিএনএ-র অধdপতন দ্বারা উৎপন্ন অলিগোনুক্লিওটাইড টুকরাগুলির অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন-ডিএনএ দূষণ রোধ করতে উচ্চমানের আরএনএ বের করুন।

RT-PCR হল RNA কে উল্টে cDNA তে প্রতিলিপি করা, এবং তারপর টার্গেট ফ্র্যাগমেন্টকে বাড়ানোর জন্য PCR রিয়্যাকশনের টেমপ্লেট হিসেবে রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্ট cDNA ব্যবহার করা। পরীক্ষার নির্দিষ্ট শর্ত অনুযায়ী এলোমেলো প্রাইমার, অলিগো ডিটি এবং জিন নির্দিষ্ট প্রাইমার বেছে নিন। উপরের সমস্ত প্রাইমারগুলি হেয়ারপিনের কাঠামো ছাড়াই সংক্ষিপ্ত ইউক্যারিওটিক সেল এমআরএনএর জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।

এলোমেলো প্রাইমার: হেয়ারপিন স্ট্রাকচার সহ লম্বা আরএনএর জন্য উপযুক্ত, সেইসাথে সব ধরনের আরএনএ যেমন আরআরএনএ, এমআরএনএ, টিআরএনএ ইত্যাদি।

অলিগো ডিটি: পলিএ টেইলিং সহ আরএনএর জন্য উপযুক্ত (প্রোক্যারিওটিক আরএনএ, ইউকারিওটিক ওলিগো ডিটি আরআরএনএ এবং টিআরএনএতে পলিএ লেজ নেই)। যেহেতু অলিগো ডিটি পলিএ লেজের সাথে আবদ্ধ, তাই আরএনএ নমুনার গুণমান বেশি হওয়া প্রয়োজন এবং এমনকি অল্প পরিমাণে অবনতি পূর্ণ দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ সংশ্লেষণের পরিমাণকে ব্যাপকভাবে হ্রাস করবে।

জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার: টেমপ্লেট সিকোয়েন্সের পরিপূরক, এমন অবস্থার জন্য উপযুক্ত যেখানে টার্গেট সিকোয়েন্স জানা থাকে।

দুটি উপায় আছে:

1. অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স পদ্ধতি: তত্ত্ব অনুসারে, সিডিএনএ হল বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের ডিএনএ টুকরো, তাই ইলেক্ট্রোফোরেসিসের ফলাফল স্মিয়ার। যদি আরএনএ প্রাচুর্য কম হয়, কোন পণ্য ইলেক্ট্রোফোরেসিসে দেখাবে না, কিন্তু এর অর্থ এই নয় যে কোন পণ্য পিসিআর দ্বারা পরিবর্ধিত হবে না। সাধারণভাবে, অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স সিডিএনএ সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। যদি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্সের ফলাফল থাকে, সিডিএনএর গুণগত মান মূলত নিশ্চিত করা যেতে পারে (কিছু ক্ষেত্রে, যদি লক্ষ্য জিনের অংশটি খুব দীর্ঘ হয়, তবে ব্যতিক্রম হতে পারে)।

2. যদি এই টেমপ্লেট দ্বারা কোন পরিচিত জিন পরিবর্ধিত হয়, তাহলে এই জিনের প্রাইমার দ্বারা যাচাই করা যাবে। অভ্যন্তরীণ রেফারেন্সের পরিবর্ধনের অর্থ এই নয় যে সিডিএনএতে কোনও সমস্যা নেই। যেহেতু অভ্যন্তরীণ রেফারেন্সে সিডিএনএতে প্রচুর পরিমাণে প্রাচুর্য রয়েছে, এটি প্রসারিত করা সহজ। যদি বিভিন্ন কারণে সিডিএনএ আংশিকভাবে হ্রাস পায়, সম্ভাবনার দৃষ্টিকোণ থেকে, কম প্রাচুর্যের লক্ষ্য জিনের পিসিআর ফলাফল ব্যাপকভাবে প্রভাবিত হবে। যদিও অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স এখনও প্রচুর পরিমাণে রয়েছে, পরিবর্ধন সম্ভবত প্রভাবিত হবে না।

RNA এর আংশিক অবনতি। আরএনএ এর অখণ্ডতা সনাক্ত করুন এবং বিশুদ্ধ করুন

বিভিন্ন প্রজাতির আরএনএ বিষয়বস্তু ভিন্ন হতে পারে, তবে সাধারণভাবে, নিষ্কাশিত মোট আরএনএতে জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিসে দুটি স্পষ্ট 28 এস এবং 18 এস ব্যান্ড থাকা উচিত এবং পূর্ববর্তী ব্যান্ডের উজ্জ্বলতা পরবর্তীটির চেয়ে দ্বিগুণ হওয়া উচিত। 5S ব্যান্ড নির্দেশ করে যে আরএনএ অবনমিত হয়েছে, এবং এর উজ্জ্বলতা অবনতির ডিগ্রির সমানুপাতিক। অভ্যন্তরীণ রেফারেন্সের সফল পরিবর্ধনের অর্থ এই নয় যে আরএনএর সাথে কোন সমস্যা নেই, কারণ অভ্যন্তরীণ রেফারেন্সটি প্রচুর পরিমাণে রয়েছে, যতক্ষণ অবনতি গুরুতর না হয় ততক্ষণ আরএনএ বাড়ানো যেতে পারে। ওডি₂₆₀/ওডি₂₈₀স্পেকট্রোফোটোমিটার দ্বারা পরিমাপ করা বিশুদ্ধ আরএনএ অনুপাত 1.9 এবং 2.1 এর মধ্যে হওয়া উচিত। আরএনএতে অল্প পরিমাণে প্রোটিন অপবিত্রতা অনুপাত কমাবে। যতক্ষণ মান খুব কম না হয়, RT প্রভাবিত হবে না। আরটিএর জন্য সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল আরএনএ অখণ্ডতা।

অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের সম্প্রসারণ কেবল ইঙ্গিত করতে পারে যে আরটি সফল হয়েছে, তবে এটি অগত্যা সিডিএনএ স্ট্র্যান্ডের মানের সাথে সম্পর্কিত নয়। যেহেতু অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স টুকরাগুলি আকারে ছোট এবং প্রকাশের উচ্চতর, তারা বিপরীত প্রতিলিপিতে সফল হওয়া সহজ। যাইহোক, লক্ষ্য জিনের আকার এবং অভিব্যক্তি জিন থেকে জিনে পরিবর্তিত হয়। সিডিএনএ গুণমান শুধুমাত্র অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স দ্বারা বিচার করা যায় না, বিশেষ করে 2 কেবি -র বেশি লম্বা লক্ষ্যবস্তুর জন্য।

কিছু নমুনার জটিল সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার আছে, অথবা সমৃদ্ধ GC কন্টেন্ট আছে, অথবা কম প্রাচুর্যের সাথে মূল্যবান। এই ক্ষেত্রে, টার্গেট টুকরোর আকার এবং নমুনার ভিত্তিতে উপযুক্ত বিপরীত প্রতিলিপি নির্বাচন করা উচিত। উচ্চ জিসি বিষয়বস্তু এবং জটিল মাধ্যমিক কাঠামোর সাথে আরএনএ টেমপ্লেটগুলির জন্য, নিম্ন তাপমাত্রায়, বা সাধারণ বিপরীত ট্রান্সক্রিপটেজ সহ গৌণ কাঠামো খোলা কঠিন। এই টেমপ্লেটগুলির জন্য, কোয়ান্ট রিভার্স ট্রান্সক্রিপটেজ নির্বাচন করা যেতে পারে, যেহেতু এর বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পারফরম্যান্স স্পষ্টতই এম-এমএলভি সিরিজ রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজের চেয়ে ভালো, যা বিভিন্ন আরএনএ টেমপ্লেটকে দক্ষতার সাথে প্রতিলিপি করতে পারে এবং আরএনএকে সর্বাধিক পরিমাণে সিডিএনএ প্রথম স্ট্র্যান্ডে প্রতিলিপি করতে পারে। সাধারণ রিভার্স ট্রান্সক্রিপটেজ কিট ব্যবহার করার সময়, 20 μl সিস্টেম শুধুমাত্র কার্যকরভাবে মোট RNA এর 1 μg প্রতিলিপি করতে পারে। দয়া করে কিটের সর্বোচ্চ RT ধারণক্ষমতার দিকে মনোযোগ দিন। যদি টেমপ্লেটটি অতিরিক্ত যোগ করা হয়, বিপরীত প্রতিলিপি উচ্চ প্রাচুর্যের সাথে আরএনএর পক্ষে হবে। অতএব, সিস্টেমের সর্বোচ্চ ক্ষমতা অতিক্রম না করা ভাল।

A-1 নির্ণয় করুন যে RNA মারাত্মকভাবে অবনমিত হয়েছে এবং RT সফল হলে

সাধারণভাবে, অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স পরিবর্ধনের ব্যর্থতার কারণ প্রায়শই গুরুতর আরএনএ অবনতির কারণে ঘটে। আরেকটি সম্ভাব্য কারণ বিপরীত প্রতিলিপি ব্যর্থতা। অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স সিডিএনএ সিঙ্গেল স্ট্র্যান্ডের মান বিচার করার জন্য একটি মান হিসাবে ব্যবহার করা যাবে না, তবে এটি আরএনএ মানের কোন সমস্যা না থাকলে বিপরীত প্রতিলিপি সফল কিনা তা বিচার করার জন্য একটি মান হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন প্রক্রিয়ার সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল প্রতিক্রিয়াশীলতার দক্ষতা বাড়ানোর জন্য একটি ধ্রুব তাপমাত্রা এবং একটি ধ্রুব প্রতিক্রিয়া সিস্টেম বজায় রাখা।

A-2 নির্ধারণ করুন যে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনগুলি সম্প্রসারিত করার জন্য প্রাইমারগুলি নির্ভরযোগ্য কিনা এবং যদি PCR- এ ব্যবহৃত রিএজেন্টের কোনো সমস্যা থাকে।

আপেক্ষিক পরিমাপের জন্য, রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের আগে আরএনএ অবশ্যই পরিমাপ করা উচিত, যা অনেক রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন কিটেও প্রয়োজন, উদাহরণস্বরূপ, আরএনএ ইনপুটকে 1 μg হিসাবে পরিমাপ করুন। যেহেতু বিপরীতভাবে প্রতিলিপি করা সিডিএনএ একটি মিশ্র সমাধান, যার মধ্যে রয়েছে আরএনএ, অলিগো ডিটি, এনজাইম, ডিএনটিপি এবং এমনকি সামান্য ডিএনএ অবশিষ্টাংশ, বিচ্যুতি ঘটবে, তাই সিডিএনএকে সঠিকভাবে পরিমাপ করা অসম্ভব। অতএব, আরএনএ পরিমাপ প্রয়োজনীয়। বিভিন্ন নমুনার মধ্যে বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা বিবেচনা করা, প্রাপ্ত সিডিএনএর পরিমাণ একই হওয়া উচিত এবং পরিমাণগত বিশ্লেষণ মোট আরএনএর একই পরিমাণে বিভিন্ন জিনের অভিব্যক্তি স্তরের তুলনা দেখাতে পারে। আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর করার সময়, রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের পরে পরিমাণগত সিডিএনএ প্রয়োজন হতে পারে না কারণ অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনকে রেফারেন্স হিসাবে কাজ করা যেতে পারে।

এটি প্রধানত জিনের সাথে সম্পর্কিত, এবং লম্বা খন্ডের বিপরীত প্রতিলিপি অধিকাংশ জিনের জন্য সম্ভব নয়। প্রথমত, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের দক্ষতা PCR এর তুলনায় অনেক কম। দ্বিতীয়ত, জিসি সমৃদ্ধ অঞ্চল এবং অনেক জিনের গৌণ কাঠামো বিপরীত প্রতিলিপি এবং পিসিআর উভয়কেই সীমাবদ্ধ করে। অবশেষে, পিসিআরের বিশ্বস্ততা এবং পরিবর্ধন দক্ষতা একই সময়ে গ্যারান্টি দেওয়া কঠিন। রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন প্রক্রিয়ায়, কেউ কম কপি জিনের জন্য লম্বা টুকরা পাওয়ার গ্যারান্টি দিতে পারে না, বিশেষ করে অলিগো ডিটি ব্যবহার করে। আরও জিসি সহ 5 'ইউটিআর হিসাবে, এটি আরও কঠিন। অতএব, এলোমেলো প্রাইমারের সাথে প্রতিলিপি উল্টানো, লক্ষ্যবস্তুতে প্রাকৃতিক ক্লিভেজ সাইটগুলি সন্ধান করা, বিভাগ দ্বারা সম্প্রসারিত করা এবং তারপর সীমাবদ্ধতা হজম এবং বন্ধন সম্পাদন করা একটি যুক্তিসঙ্গত পদ্ধতি। সাধারণভাবে, 2 কেবি -র চেয়ে বড় টুকরোগুলি সরাসরি প্রসারিত করা কঠিন, তবে এটি পাওয়া সবসময় অসম্ভব নয়: 1. সর্বপ্রথম, আরএনএ/এমআরএনএ -র অখণ্ডতার নিশ্চয়তা, এবং ট্রাইজোল নিষ্কাশন পছন্দ করা হয়। 2. এম-এমএলভি আরটি-পিসিআর কিট সরাসরি ব্যবহার করা যেতে পারে। অ্যানিলিংয়ের সময় বাড়ান এবং পরিবর্ধন প্রক্রিয়ায় সঠিকভাবে চক্র সংখ্যা বাড়ান। বিকল্পভাবে, নেস্টেড পিসিআর প্রয়োগ করা যেতে পারে, অথবা স্বাভাবিক পিসিআর পরিবর্ধনের আগে যথাযথভাবে বর্ধিত বিকৃতি এবং এক্সটেনশনের সময় দিয়ে প্রথমে এক বা দুটি প্রতিক্রিয়া করা যেতে পারে, যা টুকরো প্রসারিত করতে সাহায্য করতে পারে। পলিমারেজের বিশ্বস্ততার দিকে মনোযোগ দিন। 3. লম্বা তাক আদর্শ ফলাফল পেতে PCR- এ ব্যবহার করা যেতে পারে। 4. প্রোটিন এক্সপ্রেশন অ্যাপ্লিকেশনের জন্য, উচ্চ বিশ্বস্ততা পলিমারেজ প্রয়োগ করা উচিত।

TIANGEN দ্বারা প্রদত্ত রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ দুই ধরনের আছে: কোয়ান্ট/কিং RTase এবং TIANScript M-MLV। তাদের মধ্যে প্রধান পার্থক্য হল টেমপ্লেটের ইনপুট পরিমাণ। কোয়ান্ট একটি অনন্য রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, যা মলনি মুরিন লিউকেমিয়া ভাইরাস থেকে প্রাপ্ত সাধারণভাবে ব্যবহৃত এম-এমএলভি থেকে আলাদা। কোয়ান্ট একটি নতুন উচ্চ-দক্ষতা রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ যা পুনরায় ইঞ্জিনিয়ারিং Escherichia coli দ্বারা প্রকাশ করা হয়। উচ্চ বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনাল কার্যকলাপ এবং উচ্চ ফলন সহ 50 এনজি -2 μg আরএনএ বাড়ানোর জন্য কোয়ান্ট উপযুক্ত। সাধারণ এমএমএলভি বা এএমভির তুলনায়, কোয়ান্টের সবচেয়ে বড় বৈশিষ্ট্য হল এটি আরএনএ টেমপ্লেটগুলির সাথে খুব দৃ aff় সম্পর্ক এবং উচ্চ তাপমাত্রার বিকৃতি ছাড়াই জটিল টেমপ্লেটগুলি প্রতিলিপি করতে পারে। উচ্চতর জিসি সামগ্রী সহ টেমপ্লেটগুলির জন্য, বিপরীত দক্ষতা বেশি। যাইহোক, এই রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেসে RNase H কার্যকলাপ রয়েছে, যা সিডিএনএ পণ্যের দৈর্ঘ্যকে প্রভাবিত করতে পারে (<4.5 kb টেমপ্লেটগুলির জন্য উপযুক্ত)। প্রচলিত রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের জন্য, TIANScript MMLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ সুপারিশ করা হয়। এই RTase হল একটি দুর্বল RNase H কার্যকলাপ সহ একটি পরিবর্তিত এনজাইম, যা দীর্ঘ (> 5 kb) সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য উপযুক্ত।

সিডিএনএ সংশ্লেষণ এবং পরিবর্ধনের মধ্যে টিউব কভার না খুলে এক-ধাপ বিপরীত প্রতিলিপি এবং পিসিআর পরিবর্ধন সম্পন্ন হয়, যা দূষণ কমাতে সহায়ক। যেহেতু প্রাপ্ত সমস্ত সিডিএনএ নমুনাগুলি পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহৃত হয়, সংবেদনশীলতা বেশি হয়, সর্বনিম্ন 0.01 পিজি মোট আরএনএ সহ। সফল এক-ধাপের RTPCR এর জন্য, জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমারগুলি সাধারণত সিডিএনএ সংশ্লেষণ শুরু করতে ব্যবহৃত হয়। দুই ধাপের পদ্ধতি, যথা রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন এবং পিসিআর পরিবর্ধন দুই ধাপে সম্পন্ন করা হয়। প্রথমে সিডিএনএ পাওয়ার জন্য একটি আরএনএ টেমপ্লেট থেকে রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন করা হয় এবং প্রাপ্ত সিডিএনএ এক বা একাধিক ভিন্ন পিসিআর প্রতিক্রিয়ার শিকার হয়। দুই ধাপের পদ্ধতিটি সিডিএনএর প্রথম স্ট্র্যান্ডের সংশ্লেষণকে নির্দেশ করার জন্য অলিগো (ডিটি) বা এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করতে পারে এবং একটি নির্দিষ্ট নমুনা থেকে সমস্ত এমআরএনএ তথ্য প্রতিলিপি করতে পারে।