TIANSeq RNA Frag/cDNA সিনথেসিস মডিউল

বর্তমানে, হাই-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি মূলত পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির উপর ভিত্তি করে। যেহেতু পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির পড়ার দৈর্ঘ্য সীমাবদ্ধ, তাই আমাদের সম্পূর্ণ দৈর্ঘ্যের ক্রমকে ছোট ছোট টুকরা লাইব্রেরিতে ক্রম অনুসারে ভেঙে ফেলতে হবে। বিভিন্ন সিকোয়েন্সিং পরীক্ষার প্রয়োজন অনুসারে, আমরা সাধারণত একক-সমাপ্ত সিকোয়েন্সিং বা ডাবল-এন্ড সিকোয়েন্সিং বেছে নিই। বর্তমানে পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরির ডিএনএ টুকরাগুলি সাধারণত 200-800 বিপি এর পরিসরে বিতরণ করা হয়।

ক) ডিএনএ গুণগতভাবে দুর্বল এবং এতে ইনহিবিটারস রয়েছে। এনজাইম কার্যকলাপের বাধা এড়াতে উচ্চমানের ডিএনএ নমুনা ব্যবহার করুন।

খ) DNA গ্রন্থাগার নির্মাণের জন্য PCR- মুক্ত পদ্ধতি ব্যবহার করার সময় DNA নমুনার পরিমাণ অপর্যাপ্ত। যখন খণ্ডিত ডিএনএ-র ইনপুট 50 এনজি ছাড়িয়ে যায়, তখন পিসিআর-মুক্ত ওয়ার্কফ্লো লাইব্রেরি নির্মাণ প্রক্রিয়ার সময় বেছে বেছে করা যেতে পারে। লাইব্রেরির কপি নম্বর যদি খুব কম হয় সরাসরি অনুক্রমের জন্য, ডিএনএ লাইব্রেরি পিসিআর দ্বারা অ্যাডাপ্টার লিগেশনের পরে বাড়ানো যায়।

গ) আরএনএ দূষণের ফলে বাজে প্রাথমিক ডিএনএ পরিমাপ করা হয় জিনোমিক ডিএনএ -র পরিশোধন প্রক্রিয়ায় আরএনএ দূষণ থাকতে পারে, যা লাইব্রেরি নির্মাণের সময় ভুল ডিএনএ পরিমাপ এবং অপর্যাপ্ত ডিএনএ লোডিংয়ের দিকে নিয়ে যেতে পারে। RNase দিয়ে চিকিৎসা করে RNA অপসারণ করা যায়।

এ -1

a) ছোট টুকরা (60 bp-120 bp) প্রদর্শিত হয় Agencourt AMPure XP চুম্বকীয় জপমালা সঙ্গে পরিশোধন কার্যকরভাবে এই অ্যাডাপ্টার টুকরা অপসারণ এবং সিকোয়েন্সিং মান নিশ্চিত করতে পারেন।

খ) পিসিআর পরিবর্ধনের পর লাইব্রেরিতে বড় টুকরো দেখা যায় অ্যাডাপ্টার লাইগ্যাটেড হওয়ার পর লাইব্রেরির ডিএনএ টুকরাটির আকার 120 বিপি বৃদ্ধি পাবে। অ্যাডাপ্টার লিগেশনের পরে যদি ডিএনএ টুকরো 120 বিপি এর বেশি বৃদ্ধি পায়, তবে এটি অতিরিক্ত পিসিআর পরিবর্ধনের অস্বাভাবিক টুকরো বর্ধনের কারণে হতে পারে। পিসিআর চক্রের সংখ্যা হ্রাস পরিস্থিতি রোধ করতে পারে।

গ) অ্যাডাপ্টারের বন্ধনের পর লাইব্রেরির ডিএনএ টুকরোর অস্বাভাবিক আকার এই কিটে অ্যাডাপ্টারের দৈর্ঘ্য 60 বিপি। যখন টুকরাটির দুই প্রান্ত অ্যাডাপ্টারের সাথে সংযুক্ত করা হয়, তখন দৈর্ঘ্য মাত্র 120 বিপি বৃদ্ধি পাবে। এই কিট দ্বারা প্রদত্ত ছাড়া অন্য কোনো অ্যাডাপ্টার ব্যবহার করলে, অ্যাডাপ্টারের দৈর্ঘ্যের মতো প্রাসঙ্গিক তথ্য প্রদানের জন্য সরবরাহকারীর সাথে যোগাযোগ করুন। অনুগ্রহ করে নিশ্চিত করুন যে পরীক্ষার কার্যপ্রবাহ এবং অপারেশন ম্যানুয়ালটিতে বর্ণিত পদক্ষেপগুলি অনুসরণ করে।

d) অ্যাডাপ্টারের বন্ধনের আগে অস্বাভাবিক ডিএনএ টুকরো আকার ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্টেশনের সময় ভুল প্রতিক্রিয়ার কারণে এই সমস্যার কারণ হতে পারে। বিভিন্ন ডিএনএ ইনপুটের জন্য বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া সময় ব্যবহার করা উচিত। যদি ডিএনএ ইনপুট 10 এনজি এর বেশি হয়, আমরা অপ্টিমাইজেশনের জন্য শুরুর সময় হিসাবে 12 মিনিটের প্রতিক্রিয়া সময় বেছে নেওয়ার সুপারিশ করি এবং এই সময়ে উত্পাদিত টুকরা আকারটি মূলত 300-500 বিপি এর পরিসরে থাকে। ব্যবহারকারীরা ডিএনএ টুকরোর দৈর্ঘ্য 2-4 মিনিটের জন্য বাড়াতে বা হ্রাস করতে পারে তাদের প্রয়োজনীয় প্রয়োজনীয়তা অনুসারে ডিএনএ টুকরোগুলিকে অপ্টিমাইজ করতে।

এ -2

ক) ফ্র্যাগমেন্টেশন টাইম অপ্টিমাইজ করা হয় না যদি টুকরো করা ডিএনএ খুব ছোট বা খুব বড় হয়, অনুগ্রহ করে প্রতিক্রিয়া সময় নির্ধারণের নির্দেশে প্রদত্ত ফ্র্যাগমেন্টেশন টাইম সিলেকশনের জন্য নির্দেশিকা পড়ুন, এবং এই টাইম পয়েন্টকে কন্ট্রোল হিসেবে ব্যবহার করুন, অতিরিক্তভাবে একটি সেট আপ করুন বিভাজনের সময় আরও সঠিক সমন্বয় করতে 3 মিনিট দীর্ঘ বা ছোট করার প্রতিক্রিয়া সিস্টেম।

এ -3

ফ্র্যাগমেন্টেশন চিকিৎসার পর ডিএনএর অস্বাভাবিক আকার বিতরণ

ক) ফ্র্যাগমেন্টেশন রিএজেন্টের ভুল গলানোর পদ্ধতি, বা গলানোর পরে রিএজেন্ট পুরোপুরি মিশ্রিত হয় না। বরফের উপর 5 × ফ্র্যাগমেন্টেশন এনজাইম মিক্স রিএজেন্ট গলা। একবার গলা হয়ে গেলে, টিউবের নীচে আলতো করে ফ্লিক করে রিএজেন্ট সমানভাবে মিশ্রিত করুন। রিএজেন্ট ঘূর্ণি করবেন না!

খ) ডিএনএ ইনপুট নমুনায় রয়েছে EDTA বা অন্যান্য দূষণকারী ডিএনএ পরিশোধন ধাপে লবণ আয়ন এবং চেলটিং এজেন্টের ক্ষয় বিশেষভাবে পরীক্ষার সফলতার জন্য গুরুত্বপূর্ণ। যদি ডিএনএ 1 × TE তে দ্রবীভূত হয়, তবে বিভাজন সম্পাদনের জন্য নির্দেশে প্রদত্ত পদ্ধতিটি ব্যবহার করুন। যদি দ্রবনে EDTA- এর ঘনত্ব অনিশ্চিত হয়, তাহলে ডিএনএকে বিশুদ্ধ করার এবং পরবর্তী প্রতিক্রিয়ার জন্য ডিওনাইজড পানিতে দ্রবীভূত করার সুপারিশ করা হয়।

গ) ভুল প্রাথমিক ডিএনএ পরিমান ফ্র্যাগমেন্টেশন ট্রিটমেন্টের আগে, ক্যুবিট, পিকোগ্রিন এবং অন্যান্য পদ্ধতি ব্যবহার করে ডিএনএর সঠিক পরিমাপ করা প্রয়োজন প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের ডিএনএর সঠিক পরিমাণ নির্ধারণের জন্য।

 ঘ) প্রতিক্রিয়া পদ্ধতির প্রস্তুতি নির্দেশনা অনুসরণ করে না খণ্ডিত বিক্রিয়া পদ্ধতির প্রস্তুতি নির্দেশাবলী অনুযায়ী কঠোরভাবে বরফে চালানো উচিত। সর্বোত্তম প্রভাব নিশ্চিত করার জন্য, সমস্ত প্রতিক্রিয়া উপাদানগুলি বরফের উপর রাখা উচিত এবং সম্পূর্ণ শীতল হওয়ার পরে প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের প্রস্তুতি সম্পন্ন করা উচিত। প্রস্তুতি সম্পন্ন হওয়ার পর, পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করার জন্য দয়া করে ঝাঁকুনি বা পাইপেট করুন। ঘূর্ণি করবেন না!

1. অনুপযুক্ত মিশ্রণ পদ্ধতি (ঘূর্ণি, হিংস্র দোলন, ইত্যাদি) গ্রন্থাগারের টুকরোগুলির অস্বাভাবিক বিতরণের কারণ হবে (নিচের চিত্রটিতে দেখানো হয়েছে), এইভাবে গ্রন্থাগারের মানকে প্রভাবিত করে। অতএব, ফ্র্যাগমেন্টেশন মিক্স রিঅ্যাকশন সলিউশন প্রস্তুত করার সময়, অনুগ্রহ করে আস্তে আস্তে উপরে এবং নিচে মিশ্রিত করুন, অথবা আঙ্গুলের ডাল ব্যবহার করুন এবং সমানভাবে মিশ্রিত করুন। ঘূর্ণি সঙ্গে মিশতে না সতর্কতা অবলম্বন করুন।

2. লাইব্রেরি নির্মাণের জন্য উচ্চ বিশুদ্ধতা ডিএনএ ব্যবহার করা আবশ্যক

■ ভাল ডিএনএ অখণ্ডতা: ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যান্ড 30 কেবি এর বেশি, লেজ ছাড়া

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ডিএনএ ইনপুট পরিমাণ সঠিক হতে হবে এটি ন্যানোড্রপের পরিবর্তে ডিএনএ পরিমাপের জন্য কিউবিট এবং পিকোগ্রিন পদ্ধতি ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

4. ডিএনএ সলিউশনে EDTA- এর বিষয়বস্তু নির্ধারণ করতে হবে EDTA- এর ফ্র্যাগমেন্টেশন রিঅ্যাকশনে দারুণ প্রভাব রয়েছে। যদি EDTA- এর বিষয়বস্তু বেশি হয়, তাহলে পরবর্তী পরীক্ষার আগে DNA পরিশোধন করা প্রয়োজন।

5. ফ্র্যাগমেন্টেশন রিঅ্যাকশন সলিউশন বরফের উপর প্রস্তুত করা আবশ্যক। ফ্র্যাগমেন্টেশন প্রক্রিয়া প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা এবং সময় (বিশেষ করে বর্ধক যোগ করার পরে) সংবেদনশীল। প্রতিক্রিয়া সময়ের নির্ভুলতা নিশ্চিত করার জন্য, দয়া করে বরফে প্রতিক্রিয়া ব্যবস্থা প্রস্তুত করুন।

6. ফ্র্যাগমেন্টেশন রিঅ্যাকশন টাইম সঠিক হতে হবে ফ্র্যাগমেন্টেশন স্টেপের রিঅ্যাকশন টাইম সরাসরি ফ্র্যাগমেন্ট প্রোডাক্টের সাইজকে প্রভাবিত করবে, এভাবে লাইব্রেরিতে ডিএনএ টুকরোর সাইজ ডিস্ট্রিবিউশনকে প্রভাবিত করবে।

1. কিটের জন্য কোন ধরনের নমুনা প্রযোজ্য?

এই কিটের প্রযোজ্য নমুনার ধরন মোট আরএনএ হতে পারে বা ভাল আরএনএ অখণ্ডতার সাথে বিশুদ্ধ এমআরএনএ হতে পারে। যদি লাইব্রেরি তৈরিতে মোট RNA ব্যবহার করা হয়, তাহলে প্রথমে rRNA অপসারণের জন্য rRNA হ্রাসের কিট (Cat#4992363/4992364/4992391) ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

2. এই কিট দিয়ে লাইব্রেরি নির্মাণে FFPE নমুনা ব্যবহার করা যাবে?

এফএফপিই নমুনায় এমআরএনএ আপেক্ষিক দুর্বল অখণ্ডতার সাথে একটি নির্দিষ্ট পরিমাণে হ্রাস পাবে। লাইব্রেরি নির্মাণের জন্য এই কিটটি ব্যবহার করার সময়, ফ্র্যাগমেন্টেশন টাইম অপ্টিমাইজ করার সুপারিশ করা হয় (ফ্র্যাগমেন্টেশন টাইম ছোট করা বা ফ্র্যাগমেন্টেশন না করা)।

3. প্রোডাক্ট ম্যানুয়ালে দেওয়া সাইজ সিলেকশন স্টেপ ব্যবহার করে, insোকানো অংশটি কি সামান্য বিচ্যুতি দেখা দিতে পারে?

এই পণ্য ম্যানুয়ালের আকার নির্বাচন ধাপ অনুযায়ী কঠোরভাবে মাপ নির্বাচন করা হবে। যদি বিচ্যুতি হয়, তাহলে কারণ হতে পারে যে চৌম্বকীয় জপমালা ঘরের তাপমাত্রার সাথে ভারসাম্যপূর্ণ নয় বা পুরোপুরি মিশ্রিত নয়, পিপেটটি সঠিক নয় বা তরল টিপের মধ্যে রয়ে গেছে। পরীক্ষার জন্য কম শোষণ সহ টিপস ব্যবহার করার সুপারিশ করা হয়।

4. লাইব্রেরি নির্মাণে অ্যাডাপ্টার নির্বাচন

লাইব্রেরি নির্মাণ কিটে অ্যাডাপ্টার রিএজেন্ট থাকে না, এবং এই কিট টিআইএএনএসইক সিঙ্গল-ইনডেক্স অ্যাডাপ্টার (ইলুমিনা) (4992641/4992642/4992378) এর সাথে ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

5. লাইব্রেরির QC

লাইব্রেরির পরিমাণগত সনাক্তকরণ: লাইব্রেরির ভর ঘনত্ব এবং মোলার ঘনত্ব নির্ধারণ করতে যথাক্রমে Qubit এবং qPCR ব্যবহার করা হয়। অপারেশন কঠোরভাবে পণ্য ম্যানুয়াল অনুযায়ী হয়। লাইব্রেরির ঘনত্ব সাধারণত এনজিএস সিকোয়েন্সিংয়ের প্রয়োজনীয়তা পূরণ করবে। লাইব্রেরি বিতরণ পরিসীমা সনাক্তকরণ: লাইব্রেরি বিতরণ পরিসীমা সনাক্ত করতে Agilent 2100 Bioanalyzer ব্যবহার করে।

6. পরিবর্ধন চক্র সংখ্যা নির্বাচন

নির্দেশাবলী অনুসারে, পিসিআর চক্রের সংখ্যা 6-12 এবং নমুনা ইনপুট অনুসারে প্রয়োজনীয় পিসিআর চক্রের সংখ্যা নির্বাচন করা উচিত। উচ্চ ফলনশীল লাইব্রেরিতে, অতিরিক্ত পরিবর্ধন সাধারণত বিভিন্ন ডিগ্রীতে ঘটে, যা Agilent 2100 Bioanalyzer সনাক্তকরণে লক্ষ্য সীমার শিখরের পরে একটু বড় শিখর দ্বারা প্রকাশিত হয়, অথবা Qubit এর সনাক্তকৃত ঘনত্ব qPCR এর চেয়ে কম। হালকা পরিবর্ধন একটি স্বাভাবিক ঘটনা, যা লাইব্রেরির সিকোয়েন্সিং এবং পরবর্তী ডেটা বিশ্লেষণকে প্রভাবিত করে না।

7. Agilent 2100 Bioanalyzer এর সনাক্তকরণ প্রোফাইলে স্পাইক দেখা যায়

Agilent 2100 Bioanalyzer সনাক্তকরণে স্পাইকের উপস্থিতি নমুনার অসম বিভাজনের কারণে, যেখানে নির্দিষ্ট আকারে আরো টুকরো থাকবে এবং পিসিআর সমৃদ্ধির পরে এটি আরও স্পষ্ট হয়ে উঠবে। এই ক্ষেত্রে, আকার নির্বাচন না করার পরামর্শ দেওয়া হয়, অর্থাৎ 15 মিনিটের ইনকিউবেটেডের জন্য 94 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ফ্র্যাগমেন্টেশন শর্ত সেট করুন, যেখানে টুকরা বিতরণ ছোট এবং ঘনীভূত হয় এবং একজাতিকে উন্নত করা যায়।